摘要

丛状神经纤维瘤是一种良性的周围神经肿瘤，与施万细胞中NF1肿瘤抑制因子的双等位基因丧失有关。在这里，作者证明了FLLL32，一种JAK/STAT3信号的小分子抑制剂，在施万细胞系中Nf1双等位基因缺失的条件下，可以减少小鼠的神经纤维瘤生长。FLLL32治疗或肿瘤细胞中STAT3缺失可减少神经纤维瘤中炎性细胞因子的表达和肿瘤巨噬细胞的数量。尽管抑制STAT3可以下调趋化因子CCL2和CCL12，这两种趋化因子可以通过CCR2向周围神经募集巨噬细胞，但CCR2的缺失并不能提高神经纤维瘤小鼠的存活率，也不能减少巨噬细胞的数量。有趣的是，在未经治疗的肿瘤中，巨噬细胞约占增殖细胞的20-40%。FLLL32抑制了这种增殖，也抑制了施万细胞的增殖，提示神经纤维瘤巨噬细胞聚集的局部增殖是依赖于STAT3的。STAT3信号在神经纤维瘤雪旺细胞和巨噬细胞中的功能及其作为神经纤维瘤治疗靶点的相关性值得进一步研究。

结果

1.抑制JAK2/STAT3可减少体内神经纤维瘤生长和巨噬细胞数量

FLLL32是一种JAK2/STAT3抑制剂，对一组相关的酪氨酸激酶和疾病相关激酶没有明显的拮抗作用。在DHH-CRE、Nf1fl/fl小鼠(图1A)的神经纤维瘤中，以mg/kg/天的FLL32治疗5天，抑制了STAT3-Y的磷酸化。为了测试FLLL32对神经纤维瘤的治疗效果，作者首先建立了DHH-Cre；Nf1f1/f1(n=10只FLLL32，n=5只载体)混合性别小鼠的基线神经纤维瘤体积和生长率。总体而言，用FLLL32治疗的小鼠神经纤维瘤体积显著减少(图1B)，但单个动物的反应存在相当大的异质性。FLLL32治疗并未引起体重减轻，但有50％的FLLL32治疗的小鼠出现肠粘连，据报道该化合物具有疗效。有趣的是，在对治疗有定量反应(神经纤维瘤体积减少)的FLLL32治疗的小鼠中，STAT3-Y磷酸化的比色(DAB)染色未显示，但在无反应者中存在很少(图1C)。相对于媒介物处理的小鼠，FLLL32处理的小鼠强烈抑制了FLLL32响应小鼠（响应者）的细胞增殖（Ki-67+细胞，图1D），而无响应者在Ki67阳性中表现出相当大的差异。鉴于STAT3在调节炎性肿瘤微环境中的已知作用，以及巨噬细胞和肥大细胞在神经纤维瘤生长和发展中的重要性，作者还检测了FllL32对这些细胞类型的影响。与载体对照组(IBA-1+细胞，图1E)相比，FLLL32应答者和无应答者的肿瘤巨噬细胞数量均显著减少。肥大细胞数量在赋形剂和FLLL32处理的小鼠之间没有差别(图1F)。这表明巨噬细胞的聚集部分依赖于STAT3调节的SC因子。

图1A-F

2.抑制神经纤维瘤中的STAT3可以抑制巨噬细胞趋化因子的表达

为了探讨STAT3在调节小鼠神经纤维瘤基因表达中的作用，作者利用RNA-Seq。在用FLLL32或赋形剂处理60天的DHH-Cre；Nf1FL/fl小鼠的神经纤维瘤的转录本中，差异表达基因的kegg图谱确定了一条满足整体途径显著性p值过滤器(pNDE=6.e-05，pPERT=0.，pGFDR=0.)的单一通路(#；细胞因子-细胞因子受体相互作用)(图2A)。与此途径相关的3种趋化因子：CLL6、CCL12、CCL22在FLLL32治疗的神经纤维瘤和DHH-CRE、Nf1fl/fl和Stat3fl/fl神经纤维瘤中均显著降低。重要的巨噬细胞趋化因子CCL2也有减少的趋势(图2B)。这些因素可以促进肿瘤巨噬细胞/髓系细胞的募集和功能极化。

图2A-B

接下来，作者研究了这些趋化因子是否与疾病严重程度相关。与人类疾病一样，在dhh-cre；nf1fl/fl小鼠模型中，神经纤维瘤的生长速度和治疗反应存在相当大的异质性。Vehicle和FLLL32处理的样本分别按生长速度和治疗反应进行分离。CCR2配体CCL2和Ccl12在快速生长的神经纤维瘤中的表达显著增加，而在FLLL32反应者和DHH-CRE、Nf1fl/fl和Stat3fl/fl中的表达相对于赋形剂和FLLL32无反应者是减少的(图2C)。CCL6和CCL22与疾病严重程度无关。

图2C

为了确定这些趋化因子是否在人类神经纤维瘤中也有类似的表达，作者在已发表的基因表达微阵列数据集中检测了它们的表达。CCL2在人丛状神经纤维瘤和神经纤维瘤SCs中的表达明显高于正常人SCs和神经(图2D)。CCL13(人类CCL12的直系同源基因)在正常和神经纤维瘤施万细胞群体中的表达相似，但在人类神经和神经纤维瘤中表达增加(图2D)。因此，CCL2与小鼠的疾病严重程度和FLLL32反应相关，而CCL2与人类施万细胞和组织的疾病状态相关。综上所述，这些数据表明STAT3信号调节神经纤维瘤中的细胞因子-趋化因子信号。

图2D

3.CCR2不是神经纤维瘤巨噬细胞聚集所必需的

CCL2受体CCR2在发育成肿瘤巨噬细胞的单核细胞群体的骨髓外流和组织募集中起着关键作用。CCR2可减少神经损伤和炎症以及某些肿瘤微环境中巨噬细胞的聚集。考虑到CCR2配体CCL2和CCL12的表达以及神经纤维瘤巨噬细胞的数量都因抑制STAT3而减少，作者推测这些CCR2配体的STAT3依赖的SC的产生对于肿瘤巨噬细胞的聚集和神经纤维瘤的生长是重要的(图3A)。作者建立了DHH-Cre；Nf1fl/fl；CCR2缺失小鼠来检测CCR2介导的募集在神经纤维瘤巨噬细胞聚集中的重要性。DHH-Cre；Nf1fl/fl；Ccr2缺失小鼠的存活率没有表现出比DHH-Cre；Nf1fl/fl；Ccr2杂合子和DHH-Cre；Nf1fl/f1；CCR2-野生型对照小鼠更高的存活率(图3B)。CCR2的缺失也没有显著减少从这些小鼠分离的神经纤维瘤中巨噬细胞的积聚(图3C)。CCR2的缺失无效应可能是由于补偿/多余的募集机制造成的。另外，STAT3信号可能通过促进常驻巨噬细胞的增殖和存活来促进巨噬细胞的聚集。

图3A-C

4.抑制STAT3可抑制神经纤维瘤中施万细胞和巨噬细胞的增殖

据报道，在神经纤维瘤形成的背根节/周围神经中驻留的巨噬细胞群在损伤后对炎症信号的反应扩大了10倍之多。神经纤维瘤干细胞和巨噬细胞都表达活化的(Y-磷酸化)STAT3(图4A-B)。为了确定STAT3信号是否直接或间接调节巨噬细胞的增殖，作者在用FLLL32处理后的7月龄DHH-CRE；Nf1fl/fl小鼠中检测了STAT3抑制对神经纤维瘤巨噬细胞增殖的影响。与60天的治疗不同，10天的FLLL32治疗相对于赋形剂对照不足以减少肿瘤巨噬细胞(Iba-1+细胞)的数量。用F4/80鉴定共定位实验中的巨噬细胞；F4/80、Iba-1和CD11b鉴定出相同的神经纤维瘤巨噬细胞群(98%重叠)。巨噬细胞标记物没有与T细胞(CD3)或中性粒细胞(Gr-1)标记物共存。施万细胞(Sox10+细胞)和巨噬细胞(F4/80+细胞)是赋形剂治疗的神经纤维瘤中最大的两类增殖细胞，而FLLL32治疗抑制了施万细胞和巨噬细胞的增殖(图4C-D)。这些数据表明，STAT3调节的增殖促进了神经纤维瘤中巨噬细胞的聚集。

图4A-D

在10天的FLLL32治疗中，作者还检测了抑制STAT3是否诱导巨噬细胞凋亡。

在接受flll32治疗的神经纤维瘤中，f4/80阴性细胞的凋亡率(裂解caspase3+)与载体对照组相比略有增加，并且观察到巨噬细胞突起与凋亡细胞之间的广泛接触(图4e)。这些数据表明，经FLLL32治疗的神经纤维瘤中巨噬细胞的减少是由于趋化因子介导的血源性巨噬细胞募集减少和/或肿瘤巨噬细胞增殖减少，而不是巨噬细胞死亡的增加。图4F描述了FLLL32和PSTAT3在调节神经纤维瘤中巨噬细胞聚集和细胞增殖中的可能作用。

图4E-F

结论

作者发现，FLLL32对JAK/STAT3信号的抑制减少了DHH-CRE；NF1FL/FL小鼠模型中已建立的神经纤维瘤的生长，并伴随着肿瘤巨噬细胞的减少。与STAT3在调节炎症信号中的作用一致，赋形剂和FLLL32治疗的神经纤维瘤的RNA测序分析表明，STAT3信号也调节神经纤维瘤中细胞因子的表达。对FLLL32治疗的神经纤维瘤差异基因表达的分析表明，STAT3信号与巨噬细胞募集趋化因子的表达有关。这些基因，包括CCL2和CCL12，已经确定了在肿瘤巨噬细胞募集和巨噬细胞向促肿瘤功能极化方面的作用。CCL2和Ccl12的表达与神经纤维瘤的生长和对STAT3抑制的抵抗呈正相关。CCL2在人施万细胞和神经纤维瘤中的表达也与疾病状态有关。

　　虽然目前的证据表明STAT3信号可能与人皮肤神经纤维瘤无关，但在人丛状神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤中存在显著的STAT3激活。我们证明抑制STAT3信号可以减少丛状神经纤维瘤小鼠模型中肿瘤的生长，并且STAT3在这些肿瘤中巨噬细胞的聚集中起着关键作用。作者发现STAT3信号对于神经纤维瘤干细胞产生巨噬细胞募集趋化因子和肿瘤巨噬细胞增殖是重要的。结合先前证明神经纤维瘤SC固有的STAT3信号对肿瘤细胞生存和增殖的重要性的研究，这项工作确立了STAT3是神经纤维瘤SC和神经纤维瘤炎症微环境的关键调节因子。

本文于年12月12日在线发表于Oncogene，第一作者是JonathanS.Fletcher和TatyanaV.Masyuk，通讯作者为JianqiangWu和NancyRatner，辛辛那提大学医学医院医学中心为通讯单位。

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